細(xì)胞凍存的一般方法 
 
開始細(xì)胞凍存前，仔細(xì)檢查細(xì)胞凍存所需的儀器和試劑是否齊全：一般主要有：傳代細(xì)胞單層、適宜生長液、滅活小牛血清、慶大霉素溶液、7.5％NaHC03溶液、0.25％胰蛋白酶溶液、標(biāo)簽用具：100ml方瓶（培養(yǎng)細(xì)胞用）、克氏瓶、紅翻帽塞、吸管（10ml、lml）、細(xì)胞凍存管、二甲基亞砜、CO2孵箱、超掙臺、倒置顯微鏡、2～8℃冰箱、-20℃冰箱、液氮罐

操作步驟

鏡檢細(xì)胞，挑選培養(yǎng)3～4天的細(xì)胞，生長狀態(tài)良好，無污染、異常及可疑病變細(xì)胞。配制細(xì)胞培養(yǎng)液：根據(jù)不同的細(xì)胞需用不同的基礎(chǔ)液，培養(yǎng)液配方為（基礎(chǔ)液：7.5%碳酸氫鈉：1萬單位慶大霉素=100：1：0.25）。制備細(xì)胞懸液：挑選培養(yǎng)3—4天的細(xì)胞，細(xì)胞界限清晰，具有立體感，細(xì)胞形態(tài)良好的單層細(xì)胞瓶，棄去培養(yǎng)液，先用PBS洗液沖洗細(xì)胞表面1-2次，再向克氏瓶中加入0.25%胰酶8ml，等細(xì)胞面開始出現(xiàn)裂縫時(shí)倒掉瓶中部分胰酶，大克氏瓶中保留2 ml，放置幾分鐘使細(xì)胞*脫落到胰酶中，收集含細(xì)胞的胰酶，并用培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞瓶3-4次，收集沖洗液；向收集液中補(bǔ)加以下物質(zhì)：小牛血清使終濃度為20%、二甲基亞砜使終濃度為9%；分裝：將細(xì)胞懸液混勻后，立即分裝于細(xì)胞凍存管中，每管按1～1.6ml的量分裝，擰緊管蓋；在凍存管上做好標(biāo)記，包括細(xì)胞代號及凍存日期等。

凍存

先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（2～8℃），約3-4h；接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室，約3-4 h；然后將凍存管放置液氮灌口，過夜；zui后將凍存管投入液氮保存。記錄：記錄內(nèi)容包括凍存日期、細(xì)胞代號、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。




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